亞慢性全身毒性試驗
1、定義
反復(fù)或持續(xù)接觸試驗樣品后在動物壽命期的某一階段發(fā)生的不良作用。嚙齒動物亞慢毒性研究一般為90d，其他種屬動物在不超過其壽命期的10%的階段內(nèi)。亞慢靜脈研究一般規(guī)定接觸時間為14d~28d。
2、試驗依據(jù)
本試驗依據(jù)GB/T 16886.11 或ISO 10993-11 附錄H。
3、試驗系統(tǒng)
一般采用嚙齒動物（大鼠、小鼠）。如采用非嚙齒動物應(yīng)進行科學(xué)論證。
4、試驗步驟
4.1 樣品制備
每次試驗前，按照GB/T 16886.12 制備樣品極性浸提液和非極性浸提液。
4.2 動物試驗
將24只動物隨機分為浸提液組和對照組，每組雌雄各半。
從0天開始計，對大鼠進行連續(xù)14天的注射試驗，每次注射前對大鼠進行稱重并記錄，對樣品浸提液組動物尾靜脈單次注射極性浸提液，對對照組動物尾靜脈單次注射極性對照液，于1、4、7、10和13天同時進行腹腔單次注射非極性浸提液和非極性對照液，最后一次注射結(jié)束24h后安樂死解剖，見表1。
動物解剖前禁食12h，稱取空腹體重。麻醉后，心臟取血，分別測定血液學(xué)、血液生化學(xué)各項指標；腹主動脈放血處死動物后，解剖觀察各個組織器官是否出現(xiàn)異常，稱取各臟器濕重值，計算各組織器官的臟器系數(shù)。將各臟器浸泡在10%福爾馬林固定液固定72h后，進行常規(guī)組織病理學(xué)檢查。
表1. 雙途徑給藥建議的劑量參數(shù)
動物數(shù)量/性別/組別a | 途徑 | 體積 mL/kgb | 給藥頻率 研究天數(shù)d | 注射速度 ml/min |
6 | 靜脈 | 10 | 每天注射，連續(xù)14d | ≤2 |
腹腔 | 5c | 1,4,7,10,13 | 慢速 | |
a. 溶劑對照組動物（6只/性別）需要同樣給藥。 b. 建議的注射劑量體積。 c. 最好選棉籽油。 d. 給藥天數(shù)從第0天開始。 | ||||
4.3 動物體重
在給予樣品前即時測量動物體重，以及第一次接觸后的每周(如試驗周期需要)、試驗終結(jié)時測量動物體重。
4.4 臨床觀察
觀察頻率和間隔時間宜根據(jù)毒性反應(yīng)的性質(zhì)和嚴重程度、反應(yīng)速度和恢復(fù)周期來確定。在試驗的早期階段,可能需要增加觀察次數(shù)。毒性癥狀出現(xiàn)和消失的時間、持續(xù)時間和動物死亡時間都是很重要的，特別是出現(xiàn)延遲性不良臨床癥狀或死亡的跡象。為避免動物遭受不必要的痛苦，宜對動物實施國家或國際動物福利導(dǎo)則中規(guī)定的人道終點。接觸試驗樣品后基本臨床觀察應(yīng)考慮預(yù)期作用的高峰期。
應(yīng)系統(tǒng)記錄觀察到的現(xiàn)象,并保留每只動物的觀察記錄。每天應(yīng)至少一次采用實驗室通用臨床反應(yīng)術(shù)語記錄觀察到的動物存活情況和明顯的臨床反應(yīng)。長期重復(fù)接觸研究每天應(yīng)至少兩次觀察記錄動物的發(fā)病率和死亡率。更長周期重復(fù)接觸研究可考慮至少每周一次觀察記錄更大范圍內(nèi)的不良臨床癥狀。
每日觀察和記錄供試品組和對照組動物的一般狀態(tài)，如皮膚、被毛、眼和粘膜改變，以及呼吸、循環(huán)、自主和中樞神經(jīng)系統(tǒng)和行為表現(xiàn)等狀況。采用表2給出的描述語報告。
記錄死亡的動物數(shù)并及時進行尸檢，垂死動物及時隔離并處死。
典型的眼科檢查采用檢眼鏡或其他同類適宜器具，宜在接觸試驗物質(zhì)之前和試驗期間進行檢查。最好檢查所有動物，至少檢查高劑量組和對照組動物。如檢出眼部改變，則宜對全部動物進行檢查。異常檢查宜形成文件并進行論證。
表2. 常見臨床癥狀與觀察項目
臨床觀察 | 觀察癥狀 | 涉及的系統(tǒng) |
呼吸 | 呼吸困難（腹式呼吸、氣喘）、呼吸暫停、紫紺、呼吸急促、鼻流液 | 中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）、肺、心臟 |
肌肉運動 | 嗜睡減輕或加重、扶正缺失、感覺缺乏、全身僵硬、共濟失調(diào)、異常運動、俯臥、震顫、肌束抽搐 | CNS、軀體肌肉、感覺、神經(jīng)肌肉、自主性 |
痙攣 | 陣攣、強直、強制性陣攣、昏厥、角弓反張 | CNS、神經(jīng)肌肉、自主性、呼吸 |
反射 | 角膜、翻正、牽張、對光、驚跳反射 | CNS、感覺、自主性、神經(jīng)肌肉 |
眼癥狀 | 流淚、瞳孔縮小/散大、眼球突出、上臉下垂、混濁、虹膜炎、結(jié)膜炎、血淚癥、瞬膜松弛。 | 自主性、刺激性 |
心血管癥狀 | 心動過緩、心動過速、心率不齊、血管舒張、血管收縮 | CNS、自主性、心臟、肺 |
流涎 | 過多 | 自主性 |
立毛 | 被毛粗糙 | 自主性 |
痛覺喪失 | 反應(yīng)降低 | CNS、感覺 |
肌肉狀態(tài) | 張力減退、張力亢進 | 自主性 |
胃腸 | 軟便、腹瀉、嘔吐、多尿、鼻液溢 | CNS、自主性、感覺、胃腸運動性、腎 |
皮膚 | 水腫、紅斑 | 組織損害、刺激性 |
4.5 病理學(xué)
4.5.1 臨床病理學(xué)檢查
4.5.1.1 試驗接觸周期內(nèi)和/或接觸終結(jié)時進行血液學(xué)方面的檢查，包括：凝血（PT、APTT）、血紅蛋白濃度、血細胞比容、血小板計數(shù)、紅細胞計數(shù)、白細胞計數(shù)和白細胞分類計數(shù)等；
4.5.1.2 試驗接觸周期內(nèi)和/或接觸終結(jié)時進行臨床血液生化方面的檢查，包括電解質(zhì)平衡、碳水化合物代謝和肝腎功能。某些供試品由于其特定的作用模式可能還需測定：白蛋白、ALP、ALT、AST、鈣、氯化物、膽固醇、肌酸酐、CGT、葡萄糖、無機磷、鉀、鈉、總膽紅素、總蛋白、甘油三酯、尿氮、各種酶類等，評價免疫毒性時可考慮測定總免疫球蛋白水平。
尿液檢驗不作為常規(guī)檢驗，僅在預(yù)期或觀察到有這方面的毒性反應(yīng)的情況下才考慮進行，檢驗時在實驗接觸的最后一周定時采集尿液，推薦進行一下項目檢驗：外觀、膽紅素、尿糖、酮體、隱血、蛋白、沉渣、比重或滲重、尿量。
4.5.2 大體病理學(xué)檢查
4.5.2.1 試驗接觸終結(jié)時，將全部試驗動物無痛處死后進行大體尸檢，包括體表及體表開孔、頭部、胸（腹）腔及內(nèi)臟等。
4.5.2.2 將試驗動物的腎上腺、腦、附睪、心臟、腎、肝、卵巢、脾、睪丸、胸腺和子宮在取出后盡快稱量其濕重，防止干燥以及由此造成的重量減輕。
4.5.2.3 根據(jù)供試品預(yù)期作用途徑選擇需進一步進行組織病理學(xué)檢查的器官或組織，以及供試品作用的靶器官、顯示有大體損害跡象或尺寸改變的器官和組織和供試品植入部位組織，取下后置于適宜的固定液中（10%甲醛固定液）。
應(yīng)取的臟器有：腎上腺*, 主動脈，骨髓(股骨、肋骨或胸骨)，腦* (有代表性部分,包括大腦、小腦和腦橋)，盲腸，結(jié)腸，十二指腸，附睪* ，食管，眼，膽囊(如有)，心臟* ，回腸，空腸，腎* ，肝* ，肺和支氣管(經(jīng)固定劑膨脹并浸入內(nèi)保存)，淋巴結(jié)(局部淋巴結(jié)覆蓋接觸位置,遠端淋巴結(jié)覆蓋全身作用)，乳腺(雌性)，肌肉(骨骼)，鼻甲骨(用于吸入研究)，神經(jīng)(坐骨神經(jīng)或脛骨神經(jīng),最好貼近肌肉)，卵巢* ，胰腺，甲狀旁腺，腦垂體，前列腺，直腸，唾液腺，精囊，皮膚，脊髓，脾* ，胸骨，胃，睪丸* ，腺* ，甲狀腺，氣管，膀胱，子宮* (包括子宮頸和輸卵管)，陰道。
4.5.2.4 組織病理學(xué)檢查
很多醫(yī)療器械使用的是常用材料,只是在化學(xué)添加劑的用量或類型、加工或滅菌方法上有所不同。根據(jù)器械的可浸提物/可瀝濾物的毒理學(xué)風險評估,如果確定需要對其潛在的全身毒性作用進行生物相容性/安全性評價,可考慮進行簡化的組織病理學(xué)評價。在此模型中,采用分層方法檢查限定數(shù)量的靶器官/組織。
限定的組織病理學(xué)分析宜包括表3列出的所有Ⅰ層器官/組織。如果在Ⅰ層組織或同步進行的臨床病理(臨床生化和血液學(xué))觀察到有異常或可疑結(jié)果,進行Ⅱ?qū)臃治?檢查上述全部列出的器官/組織)。
表3. 限定組織病理學(xué)器官清單
器官系統(tǒng) | 各系統(tǒng)中的臟器/組織(物種若適用) | Ⅰ層組織 |
循環(huán) | 心臟、動脈、靜脈、毛細血管、血液 | 心臟 |
消化 | 口、唾液腺、食管、肝臟、胃、膽囊、胰腺、腸(十二指腸、橫結(jié)腸、升結(jié) 腸、降結(jié)腸、回腸、空腸、盲腸、乙狀結(jié)腸)、直腸、肛門 | 肝臟 |
內(nèi)分泌 | 下丘腦、垂體、甲狀腺、甲狀旁腺、腎上腺、松果體、胰 | 腎上腺 |
排泄 | 腎臟、輸尿管、膀胱、尿道、皮膚、肺、直腸 | 腎臟 |
體被 | 皮膚、皮下組織、頭發(fā)、指甲 | 皮膚 |
淋巴 | 淋巴結(jié)、扁桃體、腺樣體、胸腺、脾 | 脾臟 |
神經(jīng) | 腦、脊髓、神經(jīng)、末梢神經(jīng)、眼、耳 | 腦 |
生殖 | 卵巢、輸卵管、子宮、陰道、乳腺、睪丸、輸精管、精囊、前列腺、陰莖 | 卵巢、睪丸 |
呼吸 | 鼻、鼻腔、咽、喉氣管、支氣管、肺 | 肺、支氣管 |
骨骼 | 股骨、肱骨、橈骨、尺骨、顱骨、胸骨、鎖骨、腓骨、脛骨、脊柱、肩胛骨、骨盆、尾椎骨、趾骨、骨髓、軟骨、韌帶 | 股骨或胸骨 |
造血 | 骨髓 | 股骨、肋骨或胸骨 |
其他 | 大體損傷包括受試部位 | 觀察到的器官或組織 |
5、結(jié)果評價
5.1 列表給出各種試驗數(shù)據(jù)，包括試驗開始時每一試驗組動物數(shù)量、出現(xiàn)損害跡象的動物數(shù)量、損害類型以及每種損害類型動物的百分率。宜統(tǒng)計學(xué)方法對數(shù)據(jù)進行分析評價，但首先要考慮生物學(xué)相關(guān)性。
5.2 對重復(fù)接觸試驗中的發(fā)現(xiàn)應(yīng)結(jié)合以前的研究發(fā)現(xiàn)、毒性作用方面的考慮及尸檢與組織病理學(xué)方面的發(fā)現(xiàn)進行評價。
5.3 分析評價試驗接觸劑量與毒性反應(yīng)產(chǎn)生的相關(guān)性、異常反應(yīng)的發(fā)生率和嚴重程度，包括行為和臨床性異常、大體損害、顯微鏡下改變、靶器官的鑒別、死亡率、以及任何其他有意義的一般性和特異性反應(yīng)。